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RGD-Ins蛋白結構、活性及其基因治療血栓研究.pdf
文檔介紹:
中國協和醫科大學
博士學位論文
RGD-Ins蛋白結構、活性及其基因治療血栓研究
姓名:劉儉
申請學位級別:博士
專業:生藥學
指導教師:郭順星;唐建國
2003.5.1
摘要段含狦δ芐蛄械蚣案謀浯兩端的兩個半胱氨酸為兩個絲氨酸的肽颼鯉蚍直鴆迦氳酵槐建了狢—惱婧吮澩鐫靨濉!猵猂—>嚀宸椒ㄎJ紫仍本論文通過基因工程的方法,把源于天然蛇毒的去整合素械囊的無活性人胰島素原籄一腫擁腂和位點之間的基因中.從而取代掉籄州分子上的幕潁菇ǔ閃礁瞿苷故綬功能序列的人源化胰島素基因,再通過分子克隆技術把這兩個基因連接到溫度誘導型表達載體質粒上,在大腸桿菌中進行高效表達澩鋝試嘉。表達產物以不溶的包含體形式存在,再經超聲破菌、包含體裂解、等電點沉淀、二硫鍵還原重組、腫由覆鬮黽***聰嘀鬮齙紉幌盜脅街枳鈧棧竦昧礁鐾變體蛋白狪和—秸叩牟煌υ謨諍笳咝虜迦氳上缺少了一對二硫鍵,使得猄—鞍字械腞功能序列及其周邊幾個氨基酸所構成的局域構象比狢—母K繕⒘榛睿狽Ω招浴6哉飭礁齙鞍姿進行的分子量測定勢追和氨基酸組成分析結果與預想的理論值相吻合,狿蚇狿纈就計紫允玖礁齙鞍拙5ヒ惶醮っ骼夢頤塹提取及純化方法所得蛋白純度很高。進一步對兩個蛋白進行性質分析及活性測定后表明:兩者與胰島素受體的結合活性均不到.ィ得髕湟島素的生物活性已基本喪失:而它們的免疫活性約是籄稨的%,暗示它們在一定程度上保留了胰島素的免疫原性。和狪對誘導的血小板凝集的半數抑制濃度分別為.嵌訠痗小鼠出血時間的延長作用也是狪的活性高于S紗絲蠢炊訰功能序列進行必要的結構限制使其具有一定的剮性有利于δ芐蛄懈玫姆⒒悠淇凝活性。為了探索狢—蛟謚瘟坪馱し姥Kǚ矯嫻目贍芐約翱尚行裕頤槍狪基因的前端加上一段胰島素的引導肽基因,再連接到真核表達載體.稀@彌苯酉蚣∪庾⑸渲柿M迸浜鮮褂玫绱┛準際醯姆椒ń瘟蘋因轉入到正常/∈蟮墓趨蘭∧冢;蠔竺扛旒觳廡∈蟪鲅J奔洹晰㈠產位滄史摘受
血糖值和血清中胰島素樣物質的含量等指標的變化,實驗結果表明轉入狢—蠔?!鼠的出袹奔涿饗匝映ぃG逯幸鵲核匱鎦屎考把糖值與轉空載體的對照組比較則沒有改變。同時我們用的方法檢測到在轉基因小鼠的骨骼肌中有狪基因的表達。通過以上實驗說明,狢—基因有可能被開發成一種新的治療和預防血管栓塞的藥物。當然,要想使狢—蜃鈧粘晌R恢衷し姥Kǖ鬧瘟蘋蠐τ糜諏俅玻剮枰W黿徊工作來積累數據。關鍵詞:出血時間,二硫鍵,抑制血小板聚集,胰島素原骨架,肽的展示δ芐蛄校蛑瘟:’!⒁灰漤捕嬰
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縮寫表堅.禾盟勘だ塹曼垂——辧圓二***二硫蘇糖醇乙二***四乙酸非變性聚丙烯酰***凝膠電泳帶有狢—虻惱婧吮澩鐫靨聚合酶鏈式反應聚乙二醇受體結合活性測定放射免疫活性測定反相蛋白快速層析猵反轉錄變性聚丙烯酰***凝焦電泳—琋,疦’一四***乙二***,三羥***氨基甲烷氨芐青霉素堿基對每分鐘計數三***乙酸十二烷基硫酸鈉——狿疦’
竺.:些堡皇塑蘭查貧血小板血漿富血小板血漿二硫硝基苯甲酸半抑制濃度
第一章前言第一節胰島素及胰島素基因工程研究概況一、胰島素研究概況狶:與粗涫茿—T諞鵲核髟1湮R鵲核韉墓討小U飭蕉園胰島素是人或動物的胰腺凸細胞所分泌的一種多肽類激素。含信號肽的前胰島素原在內質網中被切去信號肽之后,再在細胞的分泌顆粒中被類胰蛋白酶及類羧肽酶諧覣鏈和吹腃肽及其兩端的雙堿性氨基酸,從而形成具有生物活性的胰島素。它進入血液循環,調節血糖濃度并行使其它的生物學功能。胰島素的前體形式一胰島素原主要由三部分組成:礎鏈及連接二者的摹T諞島素原撓階、吹牧硬課淮嬖諏蕉約钚園被幔說腸肽與粗涫基酸是蛋白酶識別與作用的位點肽被切除后所形成的胰島素由兩條肽鏈組成.分子量約為,其中從靄被岵謝珺鏈有個氨基酸殘基。胰島素分子中共有三對二硫鍵,一對為鏈內二硫鍵,兩對鏈間二硫鍵籅琱一。與胰島素相比,胰島素原的生物活性不及前者的ァ歡秸逜、吹娜峁谷詞且謊摹R鵲核氐姆腫詠峁箍煞治A銎段:粗辛蕉甕菪虯ü鼳紸肽鏈連接,其中和溆啥蚣嗔籅鏈的中部是一段旺螺旋籅⒔艚右桓鯞回折淞蕉朔直鶚且歡臥碩院艽蟮納煺蠱稡虰一。胰島素分子中的三段菪鴕桓卣劬哂幸歡ü行緣畝督峁梗親槌閃艘鵲素分子的三維骨架,這是胰島素發揮其生物學功能所必需的最基本的空間結構要素。同時它們之間鉸鏈式的相互運動,為胰島素發揮各種復雜的生物功能提供了結構基礎”第一章前高
胰島素與胰島素原具有三對相同的二硫鍵配型,這些二硫鍵把鏈連接在一起,緊緊的束縛住整個分子。在胰島素原被酶切掉男緯梢鵲核胤腫又埃這三對二硫鍵都已經正確配對形成了,天然構象亦基本確定。胰島素原的鏈的氨基酸序列較為保守,而竊蛞蛭鎦值牟煌興鉅臁肽是鏈之間的連接肽,在胰島素原多肽分子中呈現為一個松散的環狀結構,暴露于分子的表面。在氨基酸組成中,暮行磯嗲姿園被幔蠱渚哂星姿浴K獨敕腫內核,形成一個柔性很大的突環。然而由牧擁腁、唇峁梗錘招越锨浚并具有穩定的空間結構。牡娜嶁允顧閿誚喲ネ飩縹鎦剩涓叨惹姿雜兄防止分子的聚合。同時,因為慕銑ぃ靄被岵謝槌桑蠱淞蕉擻階、戳喲Φ乃?钚園被嵊行С實藎閿詒壞鞍酌甘侗鷯肭懈睿雜欣諞鵲素原轉化為活性胰島素”圖艘鵲核卦囊患督峁珻
第二節募捌湔纖厥芴寮易逖芯肯腫二、胰島素基因工程研究概況性的人胰島素。這一系統的優點在于發酵周期短,表達量高舊。利用酵母表達系統方法存在后加工過程十分復雜,要求條件很高,最終產物得率較低等缺陷。另外,胰島素是治療吞悄蠆的特效藥,最初是從豬、牛的胰臟中提取的,但隨著人們對胰島素需求的不斷上升,已不能滿足市場的需求。七十年代中期,刈榧際蹺R鵲核氐納1倭一條新的途徑。年,大鼠胰島素基因首次在大腸桿菌中表達成功,年,來源于基因工程技術的人胰島素正式投放市場。胰島素工業化生產目前主要采用兩種表達系統:大腸桿菌表達系統“徒湍副達系統“K欠直鷂9噬狹醬笠鵲核厴荊疵攔腖和丹麥的所擁有。大腸桿菌系統利用融合蛋白形式,將胰島素礎鏈/胰島素前體連接在一個大的蛋白后進行表達。表達出來的融合蛋白通過溴化***在薓處裂解釋放出所需要的蛋白,接著將其換撬嶧螅轎榷ǖ牡シ腫友萇鎩7擲氳玫換撲嶁虯、春螅俳卸蚣刈榧耙鵲鞍酌負汪入拿窧聯合作用得到有活人們可以獲得天然胰島素原的類似物,即分泌出來的產物已經具有天然的二硫鍵及正確的耍酉呂淳涂捎玫鞍酌缸7艫姆椒ㄗ;H艘鵲核亍F溆諾鬮7置物具有天然的二硫鍵,不足之處在于酵母生長慢,且分泌量太少“胰島素基因工程的生產需要解決的問題主要是表達的高效性和穩定性。人胰島素原基因在原核宿主細胞體內不穩定,極易降解。據報道,人胰島素原基因在大腸桿菌體內的半衰期僅為種印。在大腸桿菌系統中,為了提高穩定性,通常采用融合蛋白的表達方式或者在胰島素原前面連接一段分泌肽,使之分泌到細胞間質中,免受蛋白酶的降解,或者采用多個胰島素原基因串聯表達?!啊?欽廡在£中表達多采用騎啟動子,表達的效率太低;加之其表達時間過長,生成產物幾乎完全被降解,也是其得率低的原因之一。僑腁—牡プ幟阜瘧澩鍤健T誆煌憒蔚納 內容來自淘豆網彩票怎样判断冷热号 www.ecfrr.com轉載請標明出處.
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